PCR, atau tindak balas rantai polimerase, ialah teknik makmal canggih yang digunakan secara meluas dalam perubatan dan bidang saintifik lain. Diagnostik PCR pada satu masa menjadi kejayaan sebenar dalam sains.
Penerangan
PCR Kuantitatif ialah sejenis PCR masa nyata.
Ini difahami sebagai varian PCR, di mana kinetik tindak balas sentiasa direkodkan, yang memungkinkan untuk menilai secara kualitatif kandungan jujukan nukleotida DNA tertentu dalam campuran molekul kompleks.
Kaedah PCR kuantitatif akan dibincangkan dengan lebih terperinci di bawah.
Intipati analisis
Kaedah budaya dan serologi selalunya digunakan untuk mendiagnosis jangkitan. Di bawah yang pertama, antibodi kepada patogen berjangkit dalam serum darah ditentukan. Yang kedua, bahan biologi yang diambil daripada orang yang sakit digunakan untuk menyemai medium tertentu yang sesuai untuk pertumbuhan koloni patogen. Diagnostik dalam kedua-duanyakes mungkin bertahan beberapa hari atau minggu.
Pemeriksaan PCR boleh dijalankan dengan bahan biologi berbeza yang diperoleh daripada orang yang sakit. Darah dan media dan cecair patologi, fisiologi dan biologi lain bertindak sebagai sampel. Anda boleh melakukan PCR najis atau air kencing.
Jangkitan atipikal dan virus paling kerap didiagnosis oleh PCR kuantitatif, kerana ia mungkin tidak mudah untuk didiagnosis kerana sifat khusus proses patologi yang ditimbulkan olehnya. Untuk menentukan jangkitan sedemikian, ia mengambil masa, di mana antibodi mula dihasilkan di dalam badan, ditentukan oleh kaedah serologi. Tetapi ini tidak boleh diterima dalam beberapa kes.
Kaedah menjalankan
Kaedah PCR - pengesanan makmal jangkitan dalam sampel yang diasingkan daripada pesakit (in vitro).
Untuk menjalankan tindak balas rantai polimerase, satu set reagen khas diperlukan.
Bahan ujian dimasukkan ke dalam tabung uji dengan reagen. Tiub ujian diletakkan di dalam radas khas - penguat PCR, yang direka untuk menguatkan (meningkatkan bilangan) serpihan RNA atau DNA yang dikehendaki, penguat PCR beroperasi dalam mod kitaran. Dalam mana-mana kitaran, jika sampel mengandungi urutan RNA atau DNA patogen, maka semakin banyak salinan zarah asid nukleik ini terkumpul dalam larutan. Anda boleh menentukan kehadiran patogen, dan jumlahnya dalam sampel.
Jenis PCR
Analisis kualitatif oleh PCR membolehkan anda memperoleh hasil berikut:
- negatif apabila patogen yang diminati tidak ditemui dalam sampel;
- positif jika jujukan ditemui dalam sampel yang merupakan ciri patogen tertentu.
Dengan keputusan PCR yang positif, kita boleh bercakap dengan ketepatan 95% tentang kehadiran jangkitan yang didiagnosis. Pada masa yang sama, ketepatan set PCR yang digunakan untuk tujuan diagnostik mencapai 100%.
Biasanya 5% keputusan yang salah ditentukan oleh faktor manusia. Contohnya, pelanggaran teknik analisis dan penyimpanan reagen boleh mengurangkan ketepatan kajian dengan ketara.
PCR kuantitatif mentakrifkan konsep viral load. Adalah mungkin untuk menentukan bilangan set DNA patogen dalam sampel yang diambil daripada pesakit.
Keparahan jangkitan adalah berkadar terus dengan peningkatan bilangan mereka. Anda juga boleh menentukan kejayaan terapi untuk mengurangkan viral load.
Penyerahan untuk biomaterial PCR
PCR kuantitatif dijalankan di klinik, terutamanya pada waktu pagi. Semasa lawatan ke doktor, pesakit akan diberitahu apa yang perlu diambil: mengikis, calitan, air kencing atau darah. PCR boleh mengesan patogen tanpa mengira tahap pencemaran bahan.
Untuk analisis positif, secara teori, kehadiran hanya satu patogen dalam sampel diperlukan. Dalam amalan, mereka cuba mewujudkan keadaan yang lebih baik. Terdapat beberapa cadangan untuk ini:
- jika mereka mengambil calitan atau sapuan dari kemaluanorgan, anda perlu menahan diri daripada melakukan hubungan intim tiga hari sebelum kajian;
- anda tidak boleh membasuh dengan ubat antibakteria atau mencuci diri sebelum analisis;
- tiga jam sebelum mengambil smear dari uretra, anda perlu bersabar dan tidak mengosongkan usus anda.
Jangan ikut peraturan ini semasa menderma darah.
Bagaimanakah hasil analisis PCR kuantitatif ditafsirkan?
Penilaian kuantitatif keputusan yang diperoleh
Dalam beberapa situasi klinikal, masalah keberkesanan rawatan dan / atau dinamik proses patologi muncul. Soalan sedemikian amat relevan apabila memeriksa orang yang mempunyai jangkitan kronik (virus kekurangan imun manusia, hepatitis B dan C). Semasa mendiagnosis, ia adalah berdasarkan fakta bahawa pengumpulan amplikon (produk PCR) adalah berkadar dengan kehadiran salinan gen yang dikehendaki dalam sampel yang dianalisis.
Sudah tentu, dengan mengambil kira keputusan PCR kuantitatif dilakukan oleh elektroforesis gel dengan kajian keamatan isyarat PCR khas. Juga, prasyarat untuk penilaian kuantitatif yang betul bagi keputusan yang diperolehi ialah sampel kawalan yang boleh dipercayai positif yang mengandungi bilangan salinan gen yang dikehendaki yang diketahui (contohnya, seribu salinan gen hepatitis C untuk satu tindak balas PCR). Beberapa siri pencairan kawalan kuantitatif membolehkan lengkung penentukuran dijana dan digunakan untuk menilai kandungan genokop klinikal dalam spesimen klinikal.
Dalam takrifan PCR kuantitatif, pencapaian utama ialah penciptaanprobe DNA pendarfluor yang ditambahkan pada campuran tindak balas serentak dengan primer ringkas dan membolehkan anda menjejaki proses PCR dalam masa, iaitu, PCR masa nyata.
Metodologi TaqMan merujuk kepada sintesis probe DNA pendarfluor yang khusus pada bahagian tengah amplikon dan mempunyai dua label di hujungnya. Salah satunya ialah label pendarfluor, yang kedua ialah molekul pelindapkejut untuk pendarfluor ini.
Peranti khas, yang merupakan gabungan fluorimeter dan penguat termoblock, membuat pengukuran berterusan pendarfluor dalam setiap tiub ujian (prinsip PCR masa nyata). Selepas 20-40 kitaran PCR, lengkung individu akan diperolehi untuk setiap sampel. Bilangan salinan gen yang dikehendaki yang terkandung dalam sampel ujian boleh dikira daripada lengkung penentukuran dengan sampel kawalan.
Selain itu, ciri penting pelaksanaan PCR dengan kaedah pendarfluor ialah tidak perlu membuka tiub dengan campuran PCR apabila mengambil kira hasilnya. Ini mengurangkan kemungkinan pencemaran bilik dengan produk amplifikasi, dan tidak perlu memperuntukkan kawasan kerja khas untuk elektroforesis.
Apakah yang ditunjukkan oleh transkrip PCR kuantitatif?
Apakah yang sedang ditemui?
Melalui kaedah seperti PCR kuantitatif, perubahan kualitatif dalam gen ditemui: sisipan, pemadaman dan mutasi titik. Tetapi dengan beberapa gangguan keturunan, gejala yang sepadan muncul sebagai tindak balas kepada perubahan dalam kandungan gen tertentu.
Terima kasihAnalisis kuantitatif memberikan hasil berangka, selalunya dalam IU / ml. Ini bermakna bahawa dalam satu mililiter sampel ujian, sejumlah salinan RNA atau DNA patogen tertentu, yang diukur dalam unit antarabangsa, ditemui.
Bergantung pada magnitud, tahap keterukan jangkitan didiagnosis. Darah biasanya diuji untuk menentukan viral load, kerana virus bergerak bebas dalam darah semasa sakit.
Ciri
PCR kuantitatif dalam ujian darah mempunyai dua ciri.
- Analisis dijalankan dengan kehadiran primer atau deoksiribonukleosida trifosfat, yang dilabelkan dengan label pendarfluor atau radioaktif untuk menentukan dengan tepat kandungan produk PCR yang terbentuk.
- Dalam proses PCR, tamatkan tindak balas awal sebelum terlalu banyak produk PCR muncul. Ini disebabkan oleh fakta bahawa pada peringkat akhir tepu, apabila terdapat banyak produk PCR, kedua-dua enzim itu sendiri dan substrat bertindak sebagai pautan mengehadkan tindak balas ini. Penghujung kitaran PCR seterusnya di bawah keadaan sedemikian tidak lagi dicirikan oleh penggandaan bilangan produk PCR, perbezaan kuantitatif yang tidak ketara antara sampel yang berbeza disamakan, yang agak jelas ditakrifkan pada peringkat awal selepas melalui satu siri kitaran tindak balas..
Kos diagnostik PCR
Penyelidikan PCR mempunyai kos, yang bergantung pada jenis jangkitan yang akan diuji, pada metodologi analisis dan bahan ujian. Untuk menentukan satu jangkitan, anda perlu memberi dalam200-800 rubel. Bayaran untuk mengambil biomaterial juga ditambah - kira-kira 400 rubel.
