Flow cytometry ialah kaedah penyelidikan sitologi yang digunakan untuk analisis sel yang mendalam. Kelebihannya ialah ia membolehkan anda mengkaji setiap sel secara individu. Jenis analisis ini membantu menilai beberapa parameter dalam ratusan sel dalam masa beberapa saat. Akibatnya, sitofluorimetri dianggap sebagai salah satu kaedah analisis terpantas dan paling tepat yang tersedia pada masa ini untuk saintis dan doktor.
Prinsip
Prinsip sitometri aliran adalah berdasarkan ukuran serakan cahaya dan pendarfluor (pendarfluor) sel. Suspensi sel disalurkan sebagai aliran pada kelajuan tinggi melalui sel cytometer, di mana ia disinari dengan laser. Pemfokusan hidrodinamik yang dipanggil juga dilakukan di sana. Mekanismenya ialah aliran dari sel dengan zarah yang dikaji di saluran keluar mengalir ke dalam jet luaran, yang mempunyai kelajuan yang lebih tinggi. Akibatnya, zarah dijajarkan dalam rantai tersusun.
Pra-sel dilabelkan dengan pewarna pendarfluor khas (fluorochromes). Terima kasih kepada mereka, pancaran lasermenggembirakan cahaya sekunder. Isyarat cahaya yang diterima didaftarkan oleh pengesan. Selepas itu, maklumat diproses menggunakan algoritma perisian yang membolehkan anda mengira populasi sel individu yang berbeza dalam beberapa kriteria.
Penyelidikan menggunakan mikroskop konvensional selalunya gagal membezakan antara sel yang berbeza kerana ia kelihatan sama. Cytofluorimetry boleh memberikan data lain (integriti struktur DNA), menganalisis ekspresi protein, kemandirian sel.
Memandangkan pengujaan fluorokrom memerlukan pancaran cahaya dengan panjang gelombang yang berbeza, serta jenis pengesan yang berbeza, pemasangan moden dilengkapi dengan beberapa saluran pengesanan (dari 4 hingga 30). Bilangan pemancar laser boleh dari 1 hingga 7. Peranti yang lebih kompleks membenarkan kajian berbilang parameter beberapa sifat zarah sekaligus.
Kebaikan dan keburukan
Faedah sitometri aliran termasuk:
- kelajuan pemprosesan tinggi (pendaftaran sehingga 30 ribu acara dalam 1 saat);
- kemungkinan untuk mengkaji sejumlah besar sel (sehingga 100 juta dalam sampel);
- Mengira keamatan cahaya pendarfluor;
- analisis setiap sel;
- kajian serentak proses heterogen;
- pemisahan automatik data mengikut populasi sel;
- visualisasi hasil yang berkualiti.
Ciri lain teknologi ini ialahzarah yang dianalisis boleh diwarnakan dengan beberapa larutan pendarfluor. Terima kasih kepada ini, kajian berbilang parameter berlaku.
Kelemahan termasuk kerumitan peralatan teknikal dan keperluan untuk penyediaan sampel khas.
Sytometer
Peranti pertama jenis ini telah pun muncul pada tahun 1968 di Jerman, tetapi ia mula tersebar luas kemudian. Pada masa ini, semua peranti yang berfungsi dengan kaedah sitometri aliran boleh dibahagikan kepada 2 jenis:
- peranti yang mengukur sinaran pendarfluor (dua atau lebih panjang gelombang), 10° dan 90° serakan cahaya (sudut rendah dan pengesan serakan sisi);
- peranti yang, selain daripada mengukur beberapa parameter selular, mengisih secara automatik mengikut kumpulan mengikut kriteria ini.
Pengesan serakan ke hadapan direka bentuk untuk menentukan saiz sel dan peranti serakan sisi membolehkan anda mendapatkan maklumat tentang kehadiran butiran intrasel, nisbah isipadu sitoplasma dan nukleus.
Sytometer klasik, tidak seperti mikroskop cahaya, tidak membenarkan untuk mendapatkan imej sel. Walau bagaimanapun, dalam beberapa tahun kebelakangan ini, peranti gabungan telah dibangunkan yang mampu menggabungkan keupayaan mikroskop dan sitofluorimeter. Ia akan dibincangkan di bawah.
Sitometer Pengimejan
Untuk instrumen yang digunakan dalam sitometri aliran klasik,satu ciri adalah ciri: jika kejadian yang jarang berlaku didaftarkan dalam populasi sel yang dianalisis, maka tidak ada cara untuk menilai intipatinya. Zarah-zarah ini boleh sama ada sisa-sisa sel mati atau kumpulan yang jarang berlaku. Dalam peranti konvensional, data sedemikian dikecualikan daripada aliran umum peristiwa, tetapi ialah yang boleh menjadi nilai khusus untuk analisis saintifik dan klinikal.
Sitometer aliran pengimejan generasi baharu membolehkan anda menangkap imej setiap sel yang melalui aliran melalui zon pengesan. Ia mudah untuk melihatnya dengan mengklik pada kawasan yang sepadan pada rajah, yang dipaparkan pada monitor komputer.
Kawasan permohonan
Flow cytometry ialah kaedah universal yang digunakan dalam banyak bidang perubatan dan sains:
- imunologi;
- onkologi;
- transplantologi (pemindahan sumsum tulang merah, sel stem);
- hematologi;
- toksikologi;
- biokimia (pengukuran keasidan di dalam sel, kajian parameter lain);
- farmakologi (mencipta ubat baharu);
- mikrobiologi;
- parasitologi dan virologi;
- oceanology (kajian fitoplankton untuk menilai keadaan badan air dan tugas lain);
- analisis nanoteknologi dan mikrozarah.
Imunologi
Sistem imun manusia terdiri daripada pelbagai jenis sel. Sitometri aliran dalam imunologi memungkinkan untuk menilai struktur dan fungsi mereka, iaitu, untuk menjalankan fungsi morfologi.analisis.
Penyelidikan sedemikian membantu memahami sifat kompleks imuniti. Fenotip sel berubah akibat pengaktifan oleh antigen, perkembangan patologi, dan faktor lain. Cytofluorometri boleh memisahkan subpopulasi sel imun dalam campuran kompleks dan menilai semua perubahannya dari semasa ke semasa.
Onkologi
Salah satu tugas terpenting dalam onkologi ialah pembezaan sel mengikut jenisnya. Prinsip analisis oleh sitometri aliran dalam onkohematologi adalah berdasarkan fenomena berikut: apabila sampel dirawat dengan pewarna pendarfluor khas, ia mengikat protein sitoplasma. Selepas pembahagian dalam sel yang membiak secara aktif, kandungannya berkurangan separuh. Sehubungan itu, keamatan pendaran sel berkurangan dua kali ganda.
Terdapat cara lain untuk mengesan sel yang membiak:
- penggunaan pewarna pengikat DNA (propidium iodide);
- penggunaan urasil berlabel;
- pendaftaran peningkatan tahap ekspresi protein cyclin, yang terlibat dalam pengawalan kitaran sel.
