DNA rekombinan ialah molekul yang dibentuk oleh teknik penggabungan genetik makmal untuk menggabungkan bahan genetik daripada pelbagai sumber. Ia mungkin kerana molekul DNA semua organisma mempunyai struktur kimia yang sama dan hanya berbeza dalam jujukan nukleotida di dalamnya.
Penciptaan
Pengklonan molekul ialah proses makmal yang digunakan untuk mencipta DNA rekombinan. Ia adalah salah satu daripada dua kaedah yang paling banyak digunakan, bersama-sama dengan tindak balas rantai polimerase (PCR). Ia membolehkan anda mengawal replikasi mana-mana jujukan DNA tertentu yang dipilih oleh penguji.
Terdapat dua perbezaan asas antara kaedah DNA rekombinan. Satu ialah pengklonan molekul melibatkan replikasi dalam sel hidup, manakala PCR melibatkan in vitro. Perbezaan lain ialah kaedah pertama membenarkan pemotongan dan tampalan jujukan DNA, manakala kaedah kedua dipertingkatkan dengan menyalin susunan sedia ada.
DNA Vektor
Mendapatkan DNA rekombinan memerlukan vektor pengklonan. Ia berasal daripada plasmid atau virus dan merupakan segmen yang agak kecil. Pilihan vektor untuk pengklonan molekul bergantung pada pilihan organisma perumah, saiz DNA yang akan diklon, dan sama ada molekul asing akan dinyatakan. Segmen boleh digabungkan menggunakan pelbagai kaedah seperti pengklonan enzim sekatan/ligase atau pemasangan Gibson.
Pengklonan
Dalam protokol standard, pengklonan melibatkan tujuh langkah.
- Pilih organisma hos dan vektor pengklonan.
- Mendapatkan vektor DNA.
- Pembentukan DNA klon.
- Penciptaan DNA rekombinan.
- Memperkenalkannya ke dalam organisma perumah.
- Pemilihan organisma yang mengandunginya.
- Pemilihan klon dengan sisipan DNA dan sifat biologi yang dikehendaki.
Selepas pemindahan ke dalam organisma perumah, molekul asing yang terkandung dalam binaan rekombinan mungkin atau mungkin tidak dinyatakan. Ekspresi memerlukan penstrukturan semula gen untuk memasukkan urutan yang diperlukan untuk penghasilan DNA. Ia sedang digunakan oleh mesin terjemahan hos.
Cara ia berfungsi
DNA rekombinan berfungsi apabila sel perumah mengekspresikan protein daripada gen rekombinan. Ekspresi bergantung pada mengelilingi gen dengan satu set isyarat yang memberikan arahan untuk transkripsinya. Ia termasuk promoter, pengikatan ribosom dan penamat.
Masalah timbul jika genmengandungi intron atau isyarat yang bertindak sebagai penamat untuk perumah bakteria. Ini membawa kepada penamatan pramatang. Protein rekombinan mungkin tidak diproses dengan betul, dilipat atau terdegradasi. Pengeluarannya dalam sistem eukariotik biasanya berlaku dalam yis dan kulat berfilamen. Penggunaan sangkar haiwan adalah sukar kerana memerlukan permukaan sokongan yang kuat untuk kebanyakan orang.
Sifat organisma
Organisme yang mengandungi molekul DNA rekombinan nampaknya mempunyai fenotip normal. Penampilan, tingkah laku dan metabolisme mereka biasanya tidak berubah. Satu-satunya cara untuk menunjukkan kehadiran jujukan rekombinan adalah dengan memeriksa DNA itu sendiri menggunakan ujian tindak balas rantai polimerase.
Dalam sesetengah kes, DNA rekombinan boleh mempunyai kesan berbahaya. Ini boleh berlaku apabila serpihannya yang mengandungi promoter aktif terletak di sebelah gen sel hos yang senyap sebelum ini.
Gunakan
Teknologi DNA rekombinan digunakan secara meluas dalam bioteknologi, perubatan dan penyelidikan. Proteinnya dan produk lain boleh didapati di hampir setiap farmasi Barat, klinik veterinar, pejabat doktor, makmal perubatan atau biologi.
Aplikasi yang paling biasa adalah dalam penyelidikan asas, di mana teknologi adalah penting untuk kebanyakan kerja hari ini dalam sains biologi dan bioperubatan. DNA rekombinan digunakan untuk mengenal pasti, memetakan dan menyusun gen, dan untuk menentukannyafungsi. Probe rDNA digunakan untuk menganalisis ekspresi gen dalam sel tunggal dan dalam tisu seluruh organisma. Protein rekombinan digunakan sebagai reagen dalam eksperimen makmal. Beberapa contoh khusus diberikan di bawah.
Kimosin rekombinan
Terdapat dalam abomasum, chymosin ialah enzim yang diperlukan untuk membuat keju. Ia merupakan bahan tambahan makanan yang diubah suai secara genetik pertama yang digunakan dalam industri. Enzim rekombinan yang dihasilkan secara mikrobiologi yang berstruktur serupa dengan enzim yang berasal dari anak lembu adalah lebih murah dan dihasilkan dalam kuantiti yang lebih besar.
Insulin manusia rekombinan
Insulin yang hampir diganti yang diperoleh daripada sumber haiwan (cth babi dan lembu) untuk rawatan diabetes yang bergantung kepada insulin. Insulin rekombinan disintesis dengan memperkenalkan gen insulin manusia ke dalam bakteria genus Eterichia atau yis.
Hormon Pertumbuhan
Ditetapkan untuk pesakit yang kelenjar pituitari tidak menghasilkan hormon pertumbuhan yang mencukupi untuk menyokong perkembangan normal. Sebelum hormon pertumbuhan rekombinan tersedia, ia diperoleh daripada kelenjar pituitari mayat. Amalan tidak selamat ini telah menyebabkan sesetengah pesakit menghidap penyakit Creutzfeldt-Jakob.
Faktor pembekuan rekombinan
Ini adalah protein pembekuan darah yang diberikan kepada pesakit dengan bentuk hemofilia dengan gangguan pendarahan. Mereka tidak dapat menghasilkanfaktor VIII dalam kuantiti yang mencukupi. Sebelum perkembangan faktor rekombinan VIII, protein dibuat dengan memproses sejumlah besar darah manusia daripada pelbagai penderma. Ini membawa risiko yang sangat tinggi untuk menularkan penyakit berjangkit.
Diagnosis jangkitan HIV
Setiap daripada tiga kaedah yang digunakan secara meluas untuk mendiagnosis jangkitan HIV telah dibangunkan menggunakan DNA rekombinan. Ujian antibodi menggunakan proteinnya. Ia mengesan kehadiran bahan genetik HIV menggunakan tindak balas rantai polimerase transkripsi terbalik. Perkembangan ujian itu dimungkinkan oleh pengklonan molekul dan penjujukan genom HIV.
