Kromatografi ialah salah satu kaedah untuk mengasingkan bahan. Ia digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif seterusnya bagi sifat fizikal dan kimia zarah mikro. Satu variasi teknologi ini ialah kromatografi pertalian. Idea untuk membezakan sebatian protein menggunakan sifat pertalian molekul telah diketahui dalam sains selama beberapa dekad. Walau bagaimanapun, ia telah menerima pembangunannya hanya dalam beberapa tahun kebelakangan ini, selepas pengenalan bahan hidrofilik yang sangat berliang yang digunakan sebagai matriks. Kaedah ini membolehkan menyelesaikan kedua-dua masalah analisis (pengasingan bahan dan pengenalannya) dan masalah persediaan (pemurnian, kepekatan).
Esen
Kromatografi pertalian (daripada perkataan Latin affinis - “bersebelahan”, “berkaitan”) adalah berdasarkan interaksi pertalian, iaitu pembentukan ikatan yang sangat spesifik antara molekul pengatur jarak (ligan atau affinant) dan molekul sasaran. Mekanisme ini bersifat meluas (sambungan mediator atau hormon dan reseptor, antibodi danantigen, hibridisasi polinukleotida dan jenis proses lain). Dalam bidang perubatan, kromatografi afiniti telah digunakan untuk tujuan praktikal sejak 1951
Komponen dipisahkan seperti berikut:
- larutan berfungsi yang mengandungi bahan yang akan diasingkan disalurkan melalui sorben;
- ligan yang didepositkan pada matriks sorben mengekalkan bahan ini;
- ia tertumpu (pengumpulan);
- pengekstrak bahan terpencil daripada sorben dengan mencuci dengan pelarut.
Kaedah ini membolehkan anda mengasingkan keseluruhan sel. Perbezaan daripada kromatografi serapan tradisional ialah terdapat pengikatan biospesifik yang kuat bagi komponen terpencil kepada pesorben, yang dicirikan oleh selektiviti tinggi.
Penjerap
Bahan berikut digunakan sebagai penjerap:
- Sebatian gel berasaskan agarose, polisakarida yang diperoleh daripada agar. Yang paling biasa digunakan ialah 3 jenis: sepharose 4B, CL (cross-linked agarose) dan affi-gel. Komposisi terakhir ialah gel agarose dan polyacrylamide yang diubah suai. Ia mempunyai lengai biologi yang lebih besar, rintangan kimia dan haba yang tinggi.
- Silika (gel silika).
- Kaca.
- Polimer organik.
Untuk menghapuskan halangan mekanikal semasa sentuhan ligan, bahan tambahan digunakan untuk memisahkannya daripada pembawa (peptida, diamina, poliamina, oligosakarida).
Peralatan
Peralatan kromatografi perkaitan termasuk unit utama berikut:
- tangki simpanan untuk fasa mudah alih (eluen);
- pam tekanan tinggi untuk bekalan sederhana (paling kerap berbalas);
- penapis untuk membersihkan eluen daripada habuk;
- peranti dos;
- lajur kromatografi untuk pengasingan campuran;
- pengesan untuk mengesan komponen terpisah yang meninggalkan lajur;
- perakam kromatogram dan unit mikropemproses (komputer).
Untuk mengurangkan jumlah udara terlarut, helium terlebih dahulu melalui fasa mudah alih. Untuk menukar kepekatan eluen, beberapa pam yang dikawal oleh pengaturcara dipasang. Lajur kromatografi diperbuat daripada keluli tahan karat (untuk peningkatan keperluan untuk rintangan kakisan), kaca (pilihan universal) atau akrilik. Untuk tujuan persediaan, diameternya boleh berbeza dari 2 hingga 70 cm. Dalam kromatografi analitik, lajur mikro Ø10-150 µm digunakan.
Untuk meningkatkan kepekaan pengesan, reagen dimasukkan ke dalam campuran, yang menyumbang kepada pembentukan bahan yang menyerap lebih banyak sinar dalam ultraungu atau kawasan spektrum yang boleh dilihat.
Metodologi
Terdapat 2 jenis utama kromatografi pertalian cecair:
- Lajur, di mana lajur diisi dengan fasa pegun dan campuran dilalui melaluinya dengan aliraneluent. Pemisahan boleh berlaku di bawah tekanan atau di bawah graviti.
- Lapisan nipis. Eluen bergerak di sepanjang lapisan penjerap rata di bawah pengaruh daya kapilari. Bahan penjerap digunakan pada plat kaca, seramik atau batang kuarza, kerajang logam.
Peringkat kerja utama termasuk:
- penyediaan penjerap, penetapan ligan pada pembawa;
- menyuap campuran pengasingan ke lajur kromatografi;
- pemuatan fasa mudah alih, pengikatan komponen oleh ligan;
- penggantian fasa untuk mengasingkan bahan terikat.
Destinasi
Kromatografi afiniti digunakan untuk mengasingkan jenis bahan berikut (jenis ligan yang digunakan ditunjukkan dalam kurungan):
- analogi perencat enzimatik, substrat dan kofaktor (enzim);
- bahan bioorganik dengan tanda-tanda kelainan genetik, virus dan sel (antibodi);
- karbohidrat berat molekul tinggi, polimer monosakarida, glikoprotein (lektin);
- protein nuklear, nukleotidiltransferase (asid nukleik);
- reseptor, protein pengangkutan (vitamin, hormon);
- protein yang berinteraksi dengan membran sel (sel).
Teknologi ini juga digunakan untuk mendapatkan enzim yang tidak bergerak, dan mengikatnya kepada selulosa membolehkan penghasilan imunosorben.
Kromatografi protein pengikat DNA
Pengasingan protein pengikat DNA dilakukan menggunakanheparin. Glikosaminoglikan ini mampu mengikat pelbagai molekul. Kromatografi pertalian protein kumpulan ini digunakan untuk mengasingkan bahan seperti:
- faktor permulaan dan pemanjangan terjemahan (sintesis molekul asid nukleik dan protein);
- restrictases (enzim yang mengenali urutan tertentu dalam DNA untai dua);
- DNA ligase dan polimerase (enzim yang memangkinkan penyambungan dua molekul untuk membentuk ikatan kimia baharu dan terlibat dalam replikasi DNA);
- perencat protease serin yang memainkan peranan penting dalam proses imun dan keradangan;
- faktor pertumbuhan: fibroblas, Schwann, endothelial;
- protein matriks ekstraselular;
- reseptor hormon;
- lipoprotein.
Maruah
Kaedah ini adalah salah satu yang paling khusus untuk pengasingan sebatian reaktif (enzim dan agregat yang lebih besar - virus). Walau bagaimanapun, ia digunakan bukan sahaja untuk mengasingkan bahan aktif secara biologi.
Pengesanan antibodi dalam kuantiti yang kecil, penilaian kuantitatif asid polyadenylic, penentuan cepat jisim molekul dehidrogenase, penyingkiran bahan pencemar tertentu, kajian kinetik pengaktifan bentuk tripsin yang tidak aktif, struktur molekul manusia interferon - ini bukan senarai keseluruhan kajian di mana pertalian digunakan. kromatografi. Penggunaan di klinik adalah kerana kelebihannya seperti:
- Keupayaan pembersihan yang berkesanprotein, polisakarida, asid nukleik. Mereka berbeza sedikit dalam sifat fizikal dan kimianya serta kehilangan aktiviti semasa hidrolisis, denaturasi dan jenis rawatan lain yang digunakan dalam kaedah lain.
- Kelajuan pemisahan bahan, sifat dinamik proses.
- Tidak memerlukan penulenan enzim khas dan penhomogenan isoenzim untuk menentukan pemalar pemisahan.
- Mampu mengasingkan pelbagai jenis bahan.
- Penggunaan ligan yang rendah.
- Kemungkinan pengasingan bahan dalam jumlah besar.
- Proses boleh balik pengikatan makromolekul biologi.
Teknik ini boleh digabungkan dengan yang lain, untuk mengenakan medan tambahan (graviti, elektromagnet). Ini membolehkan anda mengembangkan keupayaan teknikal kromatografi.
Kejuruteraan enzimatik
Terima kasih kepada kaedah ini, pembangunan aktif cabang bioteknologi baharu - kejuruteraan enzim bermula.
Kromatografi pertalian untuk pengasingan enzim mempunyai kelebihan berikut:
- mendapatkan enzim dalam kuantiti yang banyak hasil daripada masa yang singkat, akibatnya - pengurangan harganya;
- imobilisasi enzim boleh meluaskan skop penggunaannya dalam bidang perubatan dan industri dengan ketara;
- Perkaitan enzim dengan sokongan pepejal tidak larut memungkinkan untuk mengkaji pengaruh persekitaran mikro dan arah tindak balas, yang memainkan peranan penting dalam proses semula jadi dan fisiologi.
